Terapia Epigenómica para el Cáncer

Tema: Regulación epigenética en el tratamiento de Cáncer

Mecanismo epigenético tratado: Metilación de ADN

¿Cómo se lo hizo?:

1. Adición de grupos metilo (CH3) a las bases del ADN, principalmente en citosinas (5º carbono) que preceden a guaninas (sitios dimucleótidos CpG).
2. Hipermetilación de promotores de genes supresores, contribuyendo al desarrollo del cáncer. Se transfiere S-adenosil metionina (SAM) al ADN
3. Hipometilación global del ADN para promover la inestabilidad genómica y la activación de genes oncogénicos. Se utilizan histonas metiltransferasas involucradas en la metilación de H3 “ADN-metiltransferasas” (DNMT)
4. Iniciación del ciclo promotor

Resultados:

• A corto plazo: alta metilación en el gen E-caderina en los estadios III y IV. Por una parte, el gen hMLH1 se observa solo metilado en un 7,70% en pacientes en estadio IV.
• A largo plazo: Estos agentes modificarían los patrones de metilación del ADN o el estado de las histonas en las células tumorales a través de la alteración de la actividad de las enzimas responsables del establecimiento y mantenimiento de estos patrones.
• Las alteraciones pueden ser por un incremento de hipermetilación que conlleva una represión de la transcripción génica. En los últimos años, el interés sobre el estudio de la metilación del ADN en CCR ha ido incrementándose. Se han descrito alrededor de 50 genes relacionados con meti-lación en distintos estadios del CCR identificándose como potenciales biomarcadores.
• Se observa mayor índice de metilación en pacientes con CCR en estadio IV en el que todos los casos presentaron al menos un gen metilado; Sin embargo, se observaron diferencias en el estado de metilación de los diferentes genes en relación con el estadio del tumor. 

Referencia bibliográfica: 

1. Rojas de Atencio AE, Urdaneta-Gutiérrez KM, Zambrano Marcano JC, Atencio Rojas RA, Quintero M, Cañizalez JZ. Metilación de genes supresores tumorales en cáncer colorrectal: relación con estadío clínico de la enfermedad. Rev. colomb. Gastroenterol. [Internet]. 1 de abril de 2019 [citado 6 de marzo de 2024];34(1):1-9. Disponible en: https://revistagastrocol.com/index.php/rcg/article/view/225

Edición y recombinación de ácidos nucléicos para enfermedades monogenicas (anemia de células falciformes y la B-talasemia) mediante el uso de CRISPR-Cas9

Tipo de Edición: Ex vivo; células somáticas

Dirigido hacia: gen BCL11A de la subunidad de la hemoglobina β (HBB)

Dirigido por: ARNsg NextSeq500

Vector: Lentivirus (BB305)

Órgano a tratar: células madre y progenitoras hematopoyéticas humanas (HSPC)

Vía de administración: infundidos intravenosos con CTX001 (HSPC CD34+)

Resultados:

A corto plazo: Los investigadores del estudio clasificaron 2 eventos adversos como graves: neumonía en presencia de neutropenia y enfermedad hepática venooclusiva con síndrome de obstrucción sinusoidal (VOD-SOS), que comenzaron el día 13 del estudio.  Hemoglobina fetal aumento a una media de 29 +/- 10,8% en comparación con las células de control no editadas.

A mediano plazo: A los 2 años se mantuvieron altos niveles de alelos editados en las células CD34+ de la médula ósea y las células de sangre periférica nucleada.  En pacientes a los 18 meses se detectó incremento paulatino en la expresión de células F del 10,1% al 99,7%, sin embargo, se detectan 32-114 eventos adversos, además, de no presentar episodios vasooculsivos durante los 16,6 meses tras la infusión y los niveles de haptoglobina, lactato deshidrogensa, aspartato aminotransfera y bilirrubina total se normalizaron.

Figura 1. Edición de genes CRISPR-Cas9 para SCD y TDT

Vídeo 1. CRISPR y la edición genética 

Referencia bibliográfica:

1. Frangoul H, Cappellini D, Chen Yi-Shan, et al. Edición del gen CRISPR-Cas9 para la anemia de células falciformes y la b-talasemia. El diario Nueva Inglaterra de medicina. [INTERNET]; 2021. [citado el 14 de febrero de 2024]. 384;3 [Pág. 252-259]. Disponible en:  https://www.nejm.org/doi/full/10.1056/NEJMoa2031054?query=recirc_curatedRelated_article

Tratamiento de la artrosis de rodilla con células mesenquimales estromales expandidas

Título: Células estromales mesenquimales expandidas en la osteoartritis de rodilla

Tipo de célula madre: células mesenquimales estromales de tejido adiposo y médula ósea 

Método de obtención: 

1. Preparamos el tejido graso de las zonas a tratar mediante infiltración con solución fisiológica y adrenalina en concentración 1mg.-1.000.000, siendo las más frecuentes: abdomen, flancos, trocánteres y cara interna de muslos.
2. La extracción de tejido adiposo se realizó mediante sistema cerrado, sin contacto con el exterior, estéril, con aspiración a baja presión (media atmósfera) y utilizando cánulas de punta roma tipo mercedes de 3mm. de diámetro y de un solo uso. 
3. El tejido graso aspirado se recolectó en una bolsa estéril, en una cantidad aproximada de 150 a 200 cc. por paciente y bolsa. Este sistema colector de grasa fue denominado Planas kit

Vía de administración:  vía parenteral (Inyección intraarticular en el sitio receptor)

Tiempo: 2 semanas a 6 meses en células extraídas de tejido adiposo

Resultado: 

Los resultados del presente estudio sugieren que la inyección intraarticular de célula madre mesenquimatosa con ácido hialurónico es una terapia potencialmente beneficiosa para la artrosis de rodilla. Aunque es necesario un examen más detallado de los efectos a largo plazo, este tratamiento es mínimamente  invasivo, bien tolerado y seguro en todos los pacientes.

Figura 1: Esquema del tratamiento con células madre 

Referencias bibliográficas: 

1. Álvarez Hernández P, de la Mata Llord J. Tratamiento de la artrosis de rodilla con células mesenquimales estromales expandidas: revisión sistemática de la literatura. Reumatol Clin [Internet]. 2022;18(1):49–55. Disponible en: http://dx.doi.org/10.1016/j.reuma.2020.10.007

Tratamiento para Paludismo mediante el uso de ADN recombinante

ADN recombinante artificial

• Tema : Producción de  hidroxicloroquina , mediante la utilización de Pichia pastoris y Escherichia coli, para tratamiento de Malaria grave
• Objetivo : analizar a rango molecular y genético cultivos de Pichia pastoris capaces de producir y secretar la hidroxicloroquina.
• Gen o secuencia a clonar : gen LacZ y gen AOX1-2
• Enzima de restricción : XhoI y NotI
• Enzima Ligasa : T4 ADN ligasa 
• Vector : No viral: plasmido “pPIC3K”, “pPICZ”, “pGAPZ”, "pPIC9ILGXN", “pPICZα”, “pGAPZα” y “pUC57ILGXN"
• Célula Receptora : Pichia pastoris (Komagataella phaffii) “cepa KM71ILGXN sobre-productora” (Eucariotas: Transfección somática)
• MTG: Transducción por lipofección
• MIC : PCR, para análisis de la integración del gen, cultivo bacteriano y celular para conseguir el desarrollo de un proceso productivo para una proteína con alta pureza (1).

Ácidos nucleicos artificiales

Se puede usar el ácido nucleico bloqueado (ANB) para aumentar la estabilidad y la afinidad de los oligonucleótidos que se emplean para silenciar genes involucrados en la resistencia a la insulina o la diabetes. También se puede usar el ácido peptidonucleico (PNA) para diseñar sondas que detecten mutaciones en el gen de la insulina o en otros genes relacionados con el metabolismo de la glucosa. (2)

Figura 1:  Algoritmo de diagnóstico y tratamiento de la malaria 

Referencias bibliográficas:

1. Sandoval de Mora M. Manejo clínico-terapéutico de la malaria grave. Boletín Venezolano de Infectología [Internet]. 2022  [citado el 2 de febrero de 2024]. Disponible en: https://docs.bvsalud.org/biblioref/2022/08/1381960/03-sandoval-m-24-29-2022.pdf
2. Alfaro Murillo A, León Bratti MP. Hidroxicloroquina: Del fármaco de herencia Inca hasta la inmunología moderna. Acta méd costarric [Internet]. 2020 [citado el 2 de febrero de 2024];62(2):57–64. Disponible en: https://www.scielo.sa.cr/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0001-60022020000200057
3. García-Torres D, Sánchez-Bouza M, Sánchez-Sánchez P, Sánchez-Frenes P, Naranjo-Hernández L. Bases moleculares de la diabetes mellitus y su relación con la glicosilación no enzimática y el estrés oxidativo. Revista Finlay [revista en Internet]. 2020 [citado el 2 de febrero del 2024]; 10(3):[aprox. 10 páginas]. Disponible en: http://scielo.sld.cu/pdf/rf/v10n3/2221-2434-rf-10-03-293.pdf 

Técnica de hibridación de ADN (Microarrays) para la detección de Neumococo

Técnica de hibridación de ADN (Microarrays)

Streptococcus pneumoniae (neumococo)

El diagnóstico está basado en un molde de ADN, la técnica utilizada es hibridación mediante la tecnología de microarrays para detectar IgG específicas de tipo CPS en suero, utilizando una colección de 22 CPS de S. pneumoniae impresas en microarrays. Las enzimas de restricción empleadas son EcoRI, Hindill y BamHl, las que permiten un análisis proteómico con anticuerpos y así determinar la amplia gama de patrones de antígenos neumocócicos. La sonda especifica utilizada es: ABLMLL Dual color Dual fusión, el blotting es de tipo Southern Blot. La electroforesis, comprobó la gran afinidad de la IgG por los antígenos potenciales de S.pneumoniae. Esta técnica tiene ventajas como rapidez, sensibilidad y capacidad de analizar múltiples muestras simultáneamente. 

Figura 1. Métodos y materiales 

Figura 2. Unión de antisueros neumocócicos a CPS impresas en microarrays

Las CPS se imprimieron por triplicado en tres concentraciones diferentes (0,1, 0,03 y 0,01 mg/ml), y la unión de los antisueros en ausencia o presencia de CPS seleccionadas en solución se detectó usando estreptavidina marcada con AF647 como paso final, como se describe en la Sección Experimental.
(A) Diseño de impresión CPS. 
(B – E) Imágenes representativas de señales fluorescentes observadas para la unión del suero tipo 1 (B) y del suero combinado T en ausencia (C) o presencia de CPS 2 (D) o CPS 20 (E). 
(F – N) Gráfico de intensidades de fluorescencia para la unión del suero tipo 1 ∓ CPS 1 (F), suero de grupo 19 ∓ CPS 19A (G) o 19F (H), suero combinado R ∓ CPS 3 (I) o 4 ( J), grupo S ∓ CPS 5 (K) u 8 (L), y grupo T ∓ CPS 2 (M) o 20 (N). 
Las intensidades de fluorescencia en ausencia de CPS en solución se representan mediante columnas llenas, mientras que las de los ensayos de competencia se representan mediante columnas rayadas. Los datos mostrados corresponden a la media de puntos por triplicado y las barras de error indican la desviación estándar de la media.

Referencias bibliográficas: 

1. Campanero-Rhodes MA, Lacoma A, Prat C, García E, Solís D. Development and evaluation of a microarray platform for detection of serum antibodies against streptococcus pneumoniae capsular polysaccharides. Anal Chem [Internet]. 2020 [citado el 20 de diciembre de 2023];92(11):7437–43. Disponible en: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/32407098/

Técnica de Reacción de Cadena de la Polimerasa (PCR) para la detección de Neumococo

La PCR para la detección de neumococo es una técnica molecular que permite identificar el ADN de la bacteria Streptococcus pneumoniae, causante de la neumonía neumocócica, en muestras respiratorias o de sangre; este examen se enfoca en detectar genes como la autolisina A (LytA), neumolisina (PLY) y el Spn9802. Actualmente la PCR se enfoca en el gen LytA (encargado de la liberación de productos bacterianos proinflamatorios). Esta técnica resulta efectiva en muestras extraídas por métodos invasivos como el LCR, líquido pleural y aspirados de pulmón.

Detección de ADN neumocócico en muestras de líquido pleural utilizando la reacción en cadena de la polimerasa

TEMA: Detección de ADN neumocócico de Streptococcus pneumoniae en muestras de líquido pleural utilizando la reacción en cadena de la polimerasa.

OBJETIVO: Investigar el rendimiento de la PCR en muestras de líquido pleural para el diagnóstico de neumonía neumocócica.
MUESTRA: Líquido pleural ; extracción: usando el mini kit QIAamp DNA blood 
TIPO DE ÁCIDO NUCLÉICO: ADN genómico (ADN neumocócico)
GENES A ANALIZAR: Gen de la autolisina A (LytA)

TAMAÑO EN PARES DE BASES: 927 pb
TIPO DE PCR: PCR cuantitativa en tiempo real

PASOS

• DESNATURALIZACIÓN: 94 °C durante 5 minutos, luego 35 ciclos de desnaturalización a 94 °C durante 30 segundos
• HIBRIDACIÓN: 68 °C durante 30 segundos
• ELONGACIÓN: 72 °C durante 2 minutos

ELECTROFORESIS O VISUALIZACIÓN: 

Imagen tomada de: Méndez-Álvarez S, Pérez-Roth E. La PCR múltiple en microbiología clínica. Enferm Infecc Microbiol Clin [Internet]. 2004 [citado el 17 de diciembre de 2023];22(3):183–92. Disponible en: https://www.elsevier.es/es-revista-enfermedades-infecciosas-microbiologia-clinica-28-articulo-la-pcr-multiple-microbiologia-clinica-13058027

Referencias bibliográficas: 

1. Sanz JC, Ríos E, Rodríguez-Avial I, Ramos B, Marín M, Cercenado E. Identification of Streptococcus pneumoniae lytA , plyA and psaA genes in pleural fluid by multiplex real-time PCR. Enferm Infecc Microbiol Clin [Internet]. 2018 [citado el 15 de diciembre de 2023];36(7):428–30. Disponible en: https://www.elsevier.es/es-revista-enfermedades-infecciosas-microbiologia-clinica-28-articulo-identification-streptococcus-pneumoniae-lyta-plya-S0213005X17302173